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本周氏蛋白免疫固定操作规程(SOP)

时间:2017-10-06    点击: 次    来源:本站    作者:佚名 - 小 + 大

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一.项目名称

本周氏蛋白免疫固定电泳(HYDRAGELBENCE JONES

 

二.检验方法名称

琼脂糖凝胶免疫固定电泳

 

三.方法学原理

电泳和蛋白质免疫固定可用于检测γ-球蛋白病的标志物,单克隆免疫球蛋白。它们可以以异常条带呈现在β和γ区。有时也会在电泳时,被这些区域可溶性复合物所掩盖。

本周氏蛋白测定可在HYDRASYS进行,通过下列5个步骤:

蛋白质同时在6个泳道上具有碱性缓冲液的琼脂糖凝胶内进行电泳分离。

电泳后,ELP泳道经固定后呈现各种蛋白区带作为参考泳道,其余5个泳道被各自抗血清免疫固定:三价抗重链(γ、α、μ)、抗κ轻链(游离和非游离)、抗λ轻链(游离和非游离)、抗κ游离轻链和抗λ游离轻链。

使用滤纸和清洗液将未沉淀蛋白质除去,已被沉淀的抗原抗体复合物储留在凝胶内。

用结晶紫染料将已沉淀的蛋白质染色,多余染料在酸性介质中被洗去。

将这些免疫沉淀区带的位置与蛋白质经电泳后所观察到的异常蛋白区带进行比较。

该技术简便、快速、图象清晰,易于解释结果。

 

四.方法学溯源

1930年由Tiselius发现了移界电泳moving boundaryeectrophoresis),而后这种技术的各种局限性已逐渐被区带电泳zoneelecrrophoresis所克服区带电泳的条件和支持介质的选择是电泳成败的关键。通过免疫化学手段观察其电泳特性及抗原特性是鉴定某一蛋白成分最好的方法,免疫固定电泳技术是目前应用最广泛的方法之一。

 

五.仪器

1   型号:SEBIA  HYDRASYS (PN1210)

2   分析和计算参数:

1 处理量:约18个样本/小时

2 所需样本量:10ul

3 检验时间:约55分钟

4 重复5 性:有良好的批内和批间重复6    

7 电泳参数:电压08      300V(可选至3000V

电流0500mA

功率0100W

 

六.试剂及配套品

3   试剂

1 HYDRAGEL 1 BENCE JONES试剂盒

HYDRAGEL2 BENCE JONES试剂盒

HYDRAGEL4 BENCE JONES试剂盒

HYDRAGEL9 BENCE JONES试剂盒

商标:SEBIA

包装规格:10测试/20测试/40测试/90测试

货号:PN4321/ PN4322/ PN4324/PN4329

2 脱色液

        1  商标:SEBIA

        2  包装规格Pack for 10×100ml

3  货号PN4540

(4)    成分柠檬酸

3 洗涤液

商标SEBIA

包装规格Pack for 10×80ml

货号PN4541

成分叠氮钠

 4生理盐水

  自配

4   配套品

1.  BENCE JONES试剂抗体

1  商标SEBIA

 (2 )   包装规格Pack for 3×1ml

3  货号PN4335

        2. BENCE JONES试剂游离轻链抗体

1  商标SEBIA

 (2 )   包装规格Pack for 2×1ml

3  货号PN4336


七.操作步骤

开机,启动电泳仪。

1用于12BENCE JONES),2用于4BENCE JONES3(用于9BENCEJONES)点样梳置于整表面有数字的一端向上2分钟内完成每块加样梳的加样每孔加10ul样品然后齿梳向上把加样梳放于湿盒内5分钟。

 

 

 

电泳/免疫固定泳道

孔号

ELP

GAM

K

L

Kf

Lf

HYDRAGEL 1 BENCE JONES

1

2

3

4

5

6

HYDRAGEL 2/4 BENCE JONES

1或3号样本

2

3

4

5

6

7

2或4号样本

9

10

11

12

13

14

HYDRAGEL 9 BENCE JONES

1,4或7号样本

1

2

3

4

5

6

2,5或8号样本

7

8

9

10

11

12

3,6或9号样本

13

14

15

16

17

18

 

选择相应的电泳程序,

从包装袋内取出缓冲条,将其固定在电极支架背侧的钉上,再取出凝胶,用薄滤纸快速轻轻地吸去凝胶表面多余的液体,在温控板表面下1/3处加蒸馏水或去离子水,小凝胶片加120ul,大凝胶片加200ul。将凝胶片底边紧靠框架底边,边缘对齐边线,略弯曲凝胶片慢慢放平,注意凝胶片下面勿出现气泡。

㈤ 自然放下支架,从湿盒中取出加样梳并去除齿梳下的保护支架,12 BENCE JONES的点样梳置于支架6号位,4 BENCE JONES2只点样梳则分别置于3号和9号,9 BENCE JONES3只点样梳则分别置于26号和10号,注意点样梳上的数字必须面对操作者,关上电泳舱盖,按下键盘左侧的绿色箭头START键,电泳开始,确保仪器右侧的空气通道不被堵塞。

㈥ 电泳仪自动发出蜂鸣声,提示电泳结束,进行免疫固定操作。打开电泳盖,将加样梳和缓冲条丢弃,移走两支架,用湿纸巾擦拭电极丝,将抗体加样条装入抗体加样架上,按如下要求将动物血清抗体加入抗体加样条:

··Hydrasys 1 BENCE JONES6孔抗体加样条:每孔加8μl抗体

··Hydrasys 2/4 BENCE JONES15孔抗体加样条:2人份每孔加8μl抗体,4人份每孔加12μl抗体

··Hydrasys 9 BENCE JONES18孔抗体加样条: 每孔加8μl抗体

固定好抗体加样架,将抗体加到凝胶片上。然后关上电泳舱盖,按Start键开始孵育。

10分钟后,电泳仪自动发出蜂鸣声,提示PAPER BLOTTING移走抗体加样架,弃去抗体加样条,放一厚滤纸光面向下盖于于凝胶表面, 左手固定好滤纸,右手手指用力的摩擦滤纸表面,注意勿将滤纸移动,关闭电泳舱盖,按Start键开始凝胶表面多余抗体的吸收。

3分钟后,电泳仪自动发出蜂鸣声,打开电泳舱盖,移去滤纸,关闭舱盖,按Start键开始凝胶片的干燥。

㈨ 6分钟后,电泳仪自动发出蜂鸣声,打开电泳舱盖,取出凝胶片,用湿纸巾擦拭温控板,将胶片固定于凝胶支架上放入染色空间中,在检查洗液瓶中是否有400ml洗液,染色液瓶内是否有300ml染色液,脱色液瓶内是否有1000ml脱色液以及是否排空了废液瓶后,菜单上选择染色指令,按Start键开始染色。

㈩ 在染色、脱色以及干燥步骤完成后,电泳仪自动发出蜂鸣声,取出凝胶支架,将烘干的胶片取下。

 

八.临床意义

确定Kappa、Lamda及游离轻链,主要诊断多发性骨髓瘤。

㈠ 一般认为,当浆细胞恶性增殖时,可能有过多的轻链产生或重链的合成被抑制,致使过多的轻链通过尿液排出。

㈡ 约50%的多发性骨髓瘤患者及约15%的巨球蛋白血症患者,其尿液可出现本-周氏蛋白。

㈢ 肾淀粉样变、慢性肾盂肾炎及恶性淋巴瘤患者等,亦可出现本周氏蛋白。

九.标本要求

取新鲜尿液进行分析,尿液置于冰箱内2℃~8℃,可保存1周,样本冰冻可延长保存时间,用HEPES0.1M(pH6.75)和/或0.2g/L叠氮钠,可提高保存稳定性。冰冻尿标本至少可在1个月内保持稳定。避免使用硼酸做为防腐剂。

不经稀释的尿液标本用于分析。本周蛋白的检出水平一般在1~5mg/dL的范围内。如需要应用浓缩尿或需要一个高的灵敏度也可取浓缩尿,20~100倍的浓缩即已足够。

混浊的尿样本(未稀释的或浓缩的)点样后很难渗透到点样器的末端,建议使用离心法(例如:3000转数/分,10分钟)或者过滤法(例如:0.45um孔径滤过器)来除去杂质微粒。

除尿标本外,病人的血清也可作本周蛋白测定,在这种情况下,免疫固定前要先用盐水或稀释液将血清稀释, 稀释液需要1/4稀释(即1份稀释液,3份蒸馏水或去离子水);ELPGAM, K L泳道1/10稀释(即1份血清,9份稀释过的稀释液或盐水),Kf Lf 泳道1/3稀释(即1份血清,2份稀释过的稀释液或盐水)。

注意:若总免疫球蛋白水平<0.5g/dL,稀释剂量应减少,例如:ELPGAM, K L泳道1/5稀释(即1份血清,4份稀释过的稀释液或盐水),Kf Lf 泳道1/2稀释(即1份血清,1份稀释过的稀释液或盐水)。

若进行Ig D / Ig E分析,则应用类似游离及结合κλ轻链的稀释方法。

㈣ 避免使用血浆标本。

一些尿标本中存在高浓度盐,可能造成凝胶在电泳时变形,必要时可先将尿液透析已消除盐分的影响。

若有细菌污染,尿液中免疫球蛋白(副蛋白)分解,分解出来异常蛋白可与游离轻链抗血清发生反应导致假阳性结果。

本周氏蛋白聚合反应,使游离抗血清轻链灵敏度降低。若结果阴性但是怀疑本周氏蛋白的存在,可在电泳前先进行解聚:将5ulβ-巯基乙醇加入100ul尿液中混匀后用盐水1/10稀释后即可应用。

 

十. 操作注意事项

㈠ 为达到最佳检测效果,同一试剂盒内的所有组分必须一并使用。

㈡ 用薄滤纸吸去凝胶表面多余液体时,接触时间不能太长,应快速移去,以免凝胶脱水。

㈢ 注意先挂缓冲条再放凝胶片,缓冲条取出时应均匀挤捏使缓冲液能分布均匀。

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