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尿蛋白电泳操作规程(SOP)

时间:2017-10-06    点击: 次    来源:本站    作者:佚名 - 小 + 大

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一.项目名称

尿蛋白电泳(HYDRAGEL PROTEINURIE

 

二.检验方法名称

SDS-琼脂糖凝胶区带电泳

 

三.方法学原理

在含有多量的阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠(SDS)液体中,蛋白质可与其连接,形成SDS—蛋白质复合物。这种复合物蛋白本身的构造已经破坏,他们都表现出相同的构造和相同的负电荷。当这种SDS—蛋白质复合物在具有适当筛选功能的介质中电泳时,如在含高浓度琼脂糖的HYDRAGEL 5 PROTEINURIE凝胶上电泳时,蛋白质按它们的分子量大小进行分离。

HYDRAGEL 5 PROTEINURIE凝胶上能清楚分离来源于肾小管(分子量<65-70KDa还是来源于肾小球(分子量>65-70KDa)的蛋白质,因此尿蛋白不仅能被检测到,而且能对蛋白来源进行分类(肾小球,肾小管性和混合性)。

 

四.方法学溯源

1930年由Tiselius发现了移界电泳(moving boundaryeectrophoresis),而后,这种技术的各种局限性已逐渐被区带电泳(zone elecrrophoresis)所克服,区带电泳的条件和支持介质的选择是电泳成败的关键。

 

五.仪器

(一)   型号:SEBIA  HYDRASYS (PN1210)

(二)   分析和计算参数:

1.  处理量:约14个样本/小时

2.  所需样本量:5ul

3.  检验时间:约50分钟

4.  重复性:有良好的批内和批间重复性

5.  电泳参数:电压0300V(可选至3000V

电流0500mA

功率0100W

 

六.试剂及配套品

(一)   试剂

1.  HYDRAGEL 5 PROTEINURIE试剂盒

(1)       商标:SEBIA

(2)       包装规格:50测试

(3)       货号:PN4115

2.  脱色液

        1  商标:SEBIA

        2  包装规格:Pack for10×100ml

3  货号:PN4540

4  成分:柠檬酸

3.洗涤液

(1)       商标:SEBIA

(2)       包装规格:Pack for 10×80ml

(3)       货号:PN4541

(4)       成分:叠氮钠

(二)   配套品

尿蛋白质控

1  商标:SEBIA

2  包装规格:Pack for 5×1ml

3  货号:PN4781

 

七.操作步骤

开机,启动电泳仪。

打开密闭的凝胶片盒,取出凝胶片并放在关闭的凝胶片盒上,用滤纸条轻柔、迅速地吸去凝胶片槽孔中的多余水分,在每一槽孔内加入5ul已处理的尿样本,注意不能有气泡,在每次加样前应擦拭移液器尖端,在整个加样过程千万不可触及槽孔的底部。

选择« PROTEINURIA 1*5 »程序进行一个凝胶片的电泳,或者« PROTEINURIA 2*5»程序进行两个凝胶片的电泳。

取出缓冲条固定在电极架上,当放一个凝胶片时将120ul蒸馏水或去离子水加在电泳舱的温控板上偏下中间处,或者在放两个凝胶片时,在偏下的左半侧和右半侧各加100ul的蒸馏水或去离子水;将凝胶片底边紧靠框架底边,边缘对齐边线,略弯曲凝胶片慢慢放平,注意凝胶片下面勿出现气泡。

自然放下支架,关上电泳舱盖,按下键盘左侧的绿色箭头START键,电泳开始,确保仪器右侧的空气通道不被堵塞

㈥ 电泳仪自动发出蜂鸣声,提示电泳结束,打开电泳盖,将加样梳和缓冲条丢弃,取出已烘干的胶片,用湿纸巾擦拭电极和温控板,将胶片固定于凝胶支架上放入染色空间中,在检查染色液瓶内是否有300ml染色液,脱色液瓶内是否有1000ml脱色液,保存液容器内是否有300ml保存液以及是否排空了废液瓶后,选择«Proteinuria»染色程序并按“start”键开始染色。

在染色、脱色以及干燥步骤完成后,电泳仪自动发出蜂鸣声,取出凝胶支架并取下已干燥的凝胶片,可用湿软的纸擦干凝胶片背面的塑料支持膜。

关机。

 

八.参考范围

本试验是定性结果。

 

九.临床意义

生理性蛋白尿:尿蛋白含量是很低的,通常低于120mg/24h,男女之间无明显差异。主要是白蛋白,有时可有极微量的转铁蛋白或免疫球蛋白,当尿蛋白>120mg/24h时,应考虑为病理性蛋白。对阳性的尿蛋白(>120mg/24h)应注意随访。

肾小球型蛋白尿:尿蛋白其特征为:分子量>65-70KDa(如白蛋白、转铁蛋白和IgG),电泳条带显示位置在样本加样点与白蛋白部分之间,白蛋白是其主要组分。

肾小管型蛋白尿:其蛋白特征为:分子量<65-70KDa,电泳条带位于白蛋白和凝胶片阳极端之间。如α1-微球蛋白,游离轻链单体,β2-微球蛋白,视黄醇结合蛋白(RBP),溶菌酶,单纯性肾小管型蛋白尿中白蛋白只占少部分。

混合型蛋白尿:其蛋白特征为肾小管及肾小球的蛋白同时并存。

通过此方法我们可以很容易地对肾脏疾病作早期诊断/鉴别诊断及分型、治疗效果的观察、肾活检(属创伤性诊断)前的筛查、甚至代替肾活检。

十.标本要求

24小时的新鲜尿液,必要时样品在2℃~8可保存一周。冷冻的样本可保存一个月。 冷冻样品中加入HEPES0.1 M(pH 6.75)和叠氮钠0.02g/dl,则可提高保存的稳定性。勿用硼酸做为防腐剂。解冻后样本可产生蛋白变性导致的细小点样痕迹。

20ul稀释液(这种液体很粘稠,吸管取时要保持垂直,慢慢吸,保证无气泡),放入小试管底部,保证粘稠液体不粘在管壁上,加80ul纯尿液,旋涡混匀5秒钟。

如果尿蛋白>0.2g/dl,则尿液先用盐水稀释至0.2g/dl左右,然后再按下列标准程序操作。

注意:混浊的尿样本(未稀释的或浓缩的)点样后很难渗透到点样器的末端,建议使用离心法(例如:3000转数/分,10分钟)或者过滤法(例如:0.45um孔径滤过器)来除去杂质微粒。

 

十一. 操作注意事项

㈠ 为达到最佳检测效果,同一试剂盒内的所有组分必须一并使用。

㈡ 用滤纸吸去凝胶表面多余液体时,接触时间不能太长,应快速移去,以免凝胶脱水。

㈢ 注意先挂缓冲条再放凝胶片,缓冲条取出时应均匀挤捏使缓冲液能分布均匀。

 

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