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血红蛋白电泳操作规程(SOP)

时间:2017-10-06    点击: 次    来源:本站    作者:佚名 - 小 + 大

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一.项目名称

血红蛋白电泳(HYDRAGEL HEMOGLOBIN

 

二.检验方法名称

琼脂糖凝胶区带电泳

 

三.方法学原理

血红蛋白的结构、分子特性取决于形成其肽链的氨基酸顺序和性状。氨基酸不同可形成不同的血红蛋白,其表面电荷不同,在电场中的泳动率不同,这还与pH、电泳缓冲液的离子强度等有关。血红蛋白异常有二种类型:血红蛋白性质或结构的异常称之为血红蛋白病。血红蛋白中的一条链合成减少引起血红蛋白性质异常,称之为地中海贫血。实验使用洗涤过红细胞的溶血液来进行,在碱性的凝胶片上进行电泳来分离血红蛋白,分离出来的片段通过氨基黑染色剂来显色,烘干后的凝胶片就可以用来解释结果了。

 

四.方法学溯源

1930年由Tiselius发现了移界电泳(moving boundaryeectrophoresis),而后,这种技术的各种局限性已逐渐被区带电泳(zone elecrrophoresis)所克服,区带电泳的条件和支持介质的选择是电泳成败的关键。

 

五.仪器

(一)   型号:SEBIA  HYDRASYS (PN1210)

(二)   分析和计算参数:

1.  处理量:约45个样本/小时

2.  所需样本量:10ul

3.  检验时间:约半小时

4.  重复性:有良好的批内和批间重复性

5.  电泳参数:电压0300V(可选至3000V

电流0500mA

功率0100W

 

六.试剂及配套品

(一)   试剂

1.  HYDRAGEL 7 HEMOGLOBINE)试剂盒

HYDRAGEL 15 HEMOGLOBINE)试剂盒

(1)       商标:SEBIA

(2)       包装规格:70测试/150测试

(3)       货号:PN4106/ PN4126

2.  脱色液

        1  商标:SEBIA

        2  包装规格:Pack for10×100ml

3  货号:PN4540

(4)    成分:柠檬酸

3.洗涤液

(1)       商标:SEBIA

(2)       包装规格:Pack for 10×80ml

(3)       货号:PN4541

(4)       成分:叠氮钠

 4.生理盐水

(二)   配套品

血红蛋白质控

1 商标:SEBIA

 (2)   包装规格:Pack for 1×1ml

(3)   货号:PN4791

 

七.操作步骤

开机,启动电泳仪。

将加样梳置于平板上,有数字的一端向上,在2分钟内完成每块加样梳的加样,每孔加10ul样品,然后齿梳向上把加样梳放于湿盒内5分钟。

选择“7/15Hb”电泳程序。当预期HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E)凝胶片上出现HbFHbS,为了更好的分离,推荐使用“7/15 Hb F-S”电泳程序。

从包装袋内取出缓冲条,将其固定在电极支架背侧的钉上,再取出凝胶,用薄滤纸快速轻轻地吸去凝胶表面多余的液体,在温控板表面下1/3120 ml[HYDRAGEL 7 HEMOGLOBINE]200ul[HYDRAGEL15 HEMOGLOBINE]蒸馏水或去离子水,将凝胶片底边紧靠框架底边,边缘对齐边线,略弯曲凝胶片慢慢放平,注意凝胶片下面勿出现气泡。

自然放下支架,从湿盒中取出加样梳并去除齿梳下的保护支架,“7/15Hb”电泳程序时,将加样梳放在4号位置,“7/15 Hb F-S”电泳程序时,将加样梳放在3号位置。注意点样梳上的数字必须面对操作者,关上电泳舱盖,按下键盘左侧的绿色箭头“START”键,电泳开始,确保仪器右侧的空气通道不被堵塞

㈥ 电泳仪自动发出蜂鸣声,提示电泳结束,打开电泳盖,将加样梳和缓冲条丢弃,取出已烘干的胶片,用湿纸巾擦拭电极和温控板,将胶片固定于凝胶支架上放入染色空间中,在检查染色液瓶内是否有300ml染色液,脱色液瓶内是否有1000ml脱色液以及是否排空了废液瓶后,选择“PROT./B1-B2/Hb”染色程序并按“start”键开始染色。

在染色、脱色以及干燥步骤完成后,电泳仪自动发出蜂鸣声,取出凝胶支架,将烘干的胶片用光密度仪进行扫描,若希望胶片背景更加清晰,在进行扫描前可以额外增加一个冲洗步骤,程序为“WASH ISOENZ/GEL”。

关机,在电脑系统上对扫描结果进行分析。

 

八.参考范围

血红蛋白A     96.5%

血红蛋白F     < 2.0%

血红蛋白A2     3.5%

 

九.临床意义

使用HYDRAGEL7/15 HEMOGLOBINE)试剂可初步筛查有无血红蛋白病和地中海贫血。若发现异常,应采用适当方法如酸性凝胶电泳等进一步分析测定,以确定异常。

以下疾病的异常图谱特征:

                                   HbA                       HbA2

α地贫          H/Barts       

β地贫                                                     >3.5

                                                           < 8

HbH           H带出现

Bart Bart带出现〉80%

S/D                             S/D

C/E                             C/E

十.标本要求

建议采用新鲜抗凝血标本。抗凝剂选用EDTA,柠檬酸或肝素均可,避免碘乙酸。采血应按照临床实验室检测要求进行。必要时,可储存于2-8,5天。

按照试剂盒内使用说明对标本进行准备:

-在进行样品准备前混匀收集试管。

-抗凝血离心,5000rpm5分钟。

-去除血浆。

-10倍体积的生理盐水洗涤红细胞2次。若红细胞体积小于10 ml,需特别小心。

-在将10ml的样本加到溶血液前,去除红细胞上层多余的生理盐水并震荡混匀。

-体积10 ml红细胞加入130 ml溶血液造成溶血。

-震荡混匀10秒钟,室温下培育5分钟即可。

注意:对于中度(10g/dl)或重度(7g/dl)贫血的病例,点样量应分别增大为15ul20ul,其结果不受影响。

H 带的血红蛋白液的制备

-在进行样品准备前混匀收集试管。

-抗凝血离心,5000rpm5分钟。

-去除血浆。

-10倍体积的生理盐水洗涤红细胞2次。若红细胞体积小于10 ml,需特别小心。

-在将40ml的样本加到溶血液前,去除红细胞上层多余的生理盐水并震荡混匀。

-体积40 ml红细胞加入100 ml溶血液造成溶血。

-震荡混匀10秒钟,室温下培育5分钟。

-离心,10000rpm5分钟即可。

㈢ 避免使用溶血标本。

十一. 操作注意事项

㈠ 为达到最佳检测效果,同一试剂盒内的所有组分必须一并使用。

㈡ 氨基黑染液的配制必须按照试剂盒内使用说明配置,否则会降低蛋白片段的检测效果。

㈢ 用薄滤纸吸去凝胶表面多余液体时,接触时间不能太长,应快速移去,以免凝胶脱水。

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