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血清蛋白电泳操作规程(SOP)

时间:2017-10-06    点击: 次    来源:本站    作者:佚名 - 小 + 大

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一. 项目名称

血清蛋白电泳(HYDRAGELPROTEIN

二.检验方法名称

琼脂糖凝胶区带电泳

三.方法学原理

蛋白电泳是临床实验室中一种常用的蛋白质剖析技术。它可以对血清或其他体液中的异常蛋白质进行筛选。它是以区带电泳为基础在一种合适的支持介质—琼脂糖上进行的电泳。血清蛋白质在给定的PH条件下主要根据其所带电荷数将其分离成五种片段:白蛋白,α1球蛋白,α2球蛋白,β球蛋白,γ球蛋白,每一区带含有一种或多种血清蛋白质。

四.方法学溯源

1930年由Tiselius发现了移界电泳(movingboundary eectrophoresis),而后,这种技术的各种局限性已逐渐被区带电泳(zone elecrrophoresis)所克服,区带电泳的条件和支持介质的选择是电泳成败的关键。血清蛋白区带电泳是在临床实验室中常用的技术之一,可定性和/或半定量各条正常或异常蛋白区带。

五.仪器

(一)型号:SEBIA  HYDRASYS(PN1210)

(二)分析和计算参数:

1.处理量:约162个样本/小时

2.所需样本量:10ul

3.检验时间:约半小时

4.重复性:有良好的批内和批间重复性

5.电泳参数:电压0300V(可选至3000V

电流0500mA

功率0100W

 

六.试剂及配套品

(一)试剂

1.HYDRAGEL 7 PROTEIN(E)试剂盒

HYDRAGEL 15 PROTEIN(E)试剂盒

HYDRAGEL 30 PROTEIN(E)试剂盒

(1)    商标:SEBIA

(2)    包装规格:70测试/150测试/300测试

(3)    货号:PN4100/ PN4120/ PN4140

2.脱色液

        1  商标:SEBIA

        2  包装规格:Pack for 10×100ml

3  货号:PN4540

(4)    成分:柠檬酸

3.洗涤液

(1)    商标:SEBIA

(2)    包装规格:Pack for 10×80ml

(3)    货号:PN4541

(4)    成分:叠氮钠

 4.稀释剂

(1)    商标:SEBIA

(2)    包装规格:Pack for 1×5ml

(3)    货号:PN4587

(二)配套品

质控血清

1  商标:SEBIA

 (2)   包装规格:Packfor 5×1ml

3  货号:PN4783

七.操作步骤

开机,启动电泳仪。

1个(用于7 PROTEIN或用于15RPOTEIN)或2个(用于30PROTEIN)加样梳置于平板上,有数字的一端向上,在2分钟内完成每块加样梳的加样,每孔加10ul样品,然后齿梳向上把加样梳放于湿盒内5分钟。

选择相应的电泳程序,使用HYDRAGEL 7 PROTEINE)时选择仪器的“PROTEIN 7”电泳程序,使用HYDRAGEL15/30 PROTEINE)时选择仪器的“PROTEIN15/30”程序。

从包装袋内取出缓冲条,将其固定在电极支架背侧的钉上,再取出凝胶,用薄滤纸快速轻轻地吸去凝胶表面多余的液体,在温控板表面下1/3120 ml[HYDRAGEL7 PROTEINE]200ul[HYDRAGEL 15 PROTEINE]蒸馏水或去离子水,将凝胶片底边紧靠框架底边,边缘对齐边线,略弯曲凝胶片慢慢放平,注意凝胶片下面勿出现气泡。

自然放下支架,从湿盒中取出加样梳并去除齿梳下的保护支架,715个样品分析的加样梳置于支架6号位,30个样品分析的加样梳则分别置于3号和9号位,注意点样梳上的数字必须面对操作者,关上电泳舱盖,按下键盘左侧的绿色箭头“START”键,电泳开始,确保仪器右侧的空气通道不被堵塞

㈥ 电泳仪自动发出蜂鸣声,提示电泳结束,打开电泳盖,将加样梳和缓冲条丢弃,取出已烘干的胶片,用湿纸巾擦拭电极和温控板,将胶片固定于凝胶支架上放入染色空间中,在检查染色液瓶内是否有300ml染色液,脱色液瓶内是否有1000ml脱色液以及是否排空了废液瓶后,选择“PROT./B1-B2/Hb”染色程序并按“start”键开始染色。

在染色、脱色以及干燥步骤完成后,电泳仪自动发出蜂鸣声,取出凝胶支架,将烘干的胶片用光密度仪进行扫描,若希望胶片背景更加清晰,在进行扫描前可以额外增加一个冲洗步骤,程序为“WASH ISOENZ/GEL”。

关机,在电脑系统上对扫描结果进行分析。

八.参考范围

白蛋白        60.071.0%

α1-球蛋白     1.42.9%

α2-球蛋白     7.011.0%

β-球蛋白      8.013.0%

γ-球蛋白      9.016.0%

九.临床意义

血清蛋白是血浆中最多的固体成分,有300多种,每种蛋白均承担一定的生理功能(如白蛋白、球蛋白、补体成分等)。很多疾病可引起各种蛋白的变化,因此分析这些变化在临床上有重要意义,并可随访病情、推测预后。

以下疾病在蛋白电泳图谱中可早期发现:

         总蛋白浓度       Alb              α1       α2       β      γ

双白蛋白血症                                           双峰

感染综合症               

急性炎症                            N                    N                                                                       N

慢性炎症                                                                                      

肝病综合症

肝炎                               N       ↓↓    ↑↓                  

肝硬化                           N      ↓↓     N       N       β-γ桥

肝癌                              N       ↓↓     甲胎蛋白N            N     N

低蛋白血症                   ↓↓       ↓↓     N       N          N

肾病综合症                   ↓↓         ↓↓            ↑↑        N

M 蛋白                                                           M蛋白峰           

蛋白缺陷型                 ←白蛋白或某种球蛋白↓↓ 

十. 标本要求

取新鲜血清进行分析,根据临床实验室对各种试验所使用的操作程序进行血清或尿样本的采集,样本置于冰箱内(28℃)可保存一周,若冰冻可延长保存时间至少一个月。冰冻的血清样本加入0.02g/dl的叠氮钠可以增加其存放稳定性。

点样时使用未经稀释的血清样本。贮存于2℃~8或经冷冻后的样品,有些血清(特点是含冷球蛋白成分)可能会变得粘稠或混浊。这些样本操作时可能存在一个点样的困难,在这种情况下,用稀释剂预处理,即加入25ul液化剂于75ul血清中,在震荡器上混匀15秒,然后按规定程序继续进行。

㈢ 避免使用溶血标本和血浆标本。

十一. 操作注意事项

㈠ 为达到最佳检测效果,同一试剂盒内的所有组分必须一并使用。

㈡ 氨基黑染液的配制必须按照试剂盒内使用说明配置,否则会降低蛋白片段的检测效果。

㈢ 用薄滤纸吸去凝胶表面多余液体时,接触时间不能太长,应快速移去,以免凝胶脱水。

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